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IMAC: Troubleshoot Guide

PROBLEM

MÖGLICHE URSACHE

MAßNAHME

Flussrate nimmt stark ab/Druck nimmt stark zu Probe enthält unlösliche Partikel. Filtration (0,45 µm) oder Zentrifugation (>14.000 g, 30 min) der Probe.
Probe enthält genomische DNA. Zugabe von DNase.
Protein fällt in der Säule aus. Denaturierender Wasch- und Elutionspuffer, Aufreinigung bei Raumtemperatur, 0.05 % Tween-20, Cofaktoren, 20 mM Mercaptoethanol.
Protein bindet nicht Vektordesign, fehlendes His-tag. Sequenzierung des Vektors, Überprüfung auf korrektes Leseraster, interne Translationsinitiatoren, ungewollte Stop-Codone.
Protein Faltung, His-tag nicht zugänglich. Isolation unter denaturierenden Bedingungen.

His-tag an das andere Ende des Proteins legen.

Proteolyse. Inhibitoren, z.B. PMSF aber nicht EDTA/EGTA.
Suboptimale Bindebedingungen. Überprüfen des pH-Werts (8.0), kein Imidazol in der Probe, weniger/kein Reduktionsmittel.
Zielprotein eluiert im Waschritt Suboptimal Waschbedingungen. Überprüfen des pH-Werts (8.0), kein Imidazol in der Probe, weniger/kein Reduktionsmittel.
Zielprotein eluiert nicht Suboptimale Elutionsbedingungen. Mehr Imidazol im Elutionspuffer, pH < 6.0
Protein fällt in der Säule aus. Denaturierender Wasch- und Elutionspuffer, Aufreinigung bei Raumtemperatur, 0.05 % Tween-20, Cofaktoren, 20 mM Mercaptoethanol.
Eluat ist nicht rein genug Waschschritt nicht ausreichend. Verdoppeln der Waschschritte/-volumina.
Waschpuffer nicht stringent genug. 5-20 mM Ammoniumchlorid, 0,5 M NaCl, 1-5 mM Imidazol, Glyzerin, Ethanol.
Intermolekulare Disulfide. Bis zu 30 mM Mercaptoethanol in Probe und/oder Waschpuffer.
Proteolyse. Verunreinigungen sind Spaltprodukte des Zielproteins. Proteaseinhibitoren verwenden.
Säule zu groß. Zu viele Bindestellen sind frei für unspezifische Interaktionen. Kleinere Säule verwenden, größeres Probenvolumen.
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