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IMAC: Wasch- und Bindebedingungen optimieren

In manchen Fällen ist die Reinheit des Zielproteins nach der IMAC unter Standardbedingungen nicht so hoch wie gewünscht. Die folgende Tabelle enthält einige Modifikationsmöglichkeiten für den Proben- und Waschpuffer, um ungewollte Proteine aus dem Eluat zu eliminieren.

MAßNAHME/
CHEMIKALIE
WIRKUNG

ERKLÄRUNG

Aminhaltige Stoffe, z.B. Glycin, Arginin, Ammoniumchlorid Kompetition um die Bindestelle am Metallion mit Histidin. Diese milden Eluenten können schwach gebundene Verunreinigungen lösen, jedoch bei höheren Konzentrationen das Zielprotein ebenfalls eluieren. Die optimale Konzentration wird empirisch ermittelt. Für erste Tests empfehlen sich Konzentrationen von 5, 50 und 100 mM.
Imidazol Kompetition um die Bindestelle am Metallion mit Histidin. Bei TED basierten Resins kann Imidazol nur in sehr geringen Mengen zum Waschen eingesetzt werden (1 - 5 mM).
Natriumchlorid Lösen von elektrostatischen Interaktionen. Die Komplexbildner der IMAC Resins können als Ionenaustauscher fungieren, insbesondere bei Salzkonzentrationen unter 0,2 M. Eine Konzentration von 0,5 M NaCl verbessert oft die Reinheit.
Nichtionische Detergenzien Lösen von hydrophoben Interaktionen Verhindert Wechselwirkungen zwischen dem Spacer-Arm und zwischen Proteinen. Entfernt ebenfalls DNA und Lipide. Triton X-114 reduziert die Belastung mit LPS. Zu beachten ist, dass Detergenzien nicht durch Dialyse entfernt werden können.
pH Beeinflusst die Ladung des Metallions Schwach gebundene Proteine können z.T. durch eine leichte Abnahme des pH-Werts (7 - 7,5) im Waschschritt entfernt werden. Dies könnte aber auch das Zielprotein eluieren.
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